Резюме. Цель работы – изучение взаимосвязи показателей целостности и функционального состояния эндотелия у больных хронической болезнью почек и гипертензией в динамике лечения с применением L- аргинина. Обследовано 112 больных с артериальной гипертензией, из них 48 больных с хроническим пиелонефритом (ХрПН), 42 больных с гипертонической болезнью (ГБ) II стадии и 22 больных с острым коронарным синдромом (ОКС). В динамике лечения с применением ингибиторов АПФ и блокаторов рецепторов к ангиотензину II в плазме крови исследовали содержание стабильных метаболитов NO, VE-кадгерина (СD-144), фактора Виллебранда (vWF), а также содержание в крови циркулирующих клеток эндотелия. У 27 больных ХрПН и 23 больных ГБ наряду с базовой терапией применяли Тивортин (L-аргинин). Установлено, что применение препарата для внутривенного введения на фоне общепринятой гипотензивной и ренопротекторной терапии способствует улучшению показателей целостности эндотелия и его NO-продуцирующей способности.
Ключевые слова: гипертензия, хроническая болезнь почек, эндотелий, L-аргинин.

   Введение.
Одной из чрезвычайно важных функции клеток у большинства, если не во всех органах человека и животных является продукция оксида азота (NO) из L-аргинина. Неспособность клеток производить NO приводит к нарушению кровотока и повреждению органов. Нарушения в системе L-аргинин/NO у больных хронической болезнью почек (ХБП) характеризуются снижением синтеза NO вследствие дефицита субстрата для NO-синтаз (NOS) – L-аргинина и повышением концентрации эндогенного ингибитора NO-синтаз – асимметричного диметиларгинина (АДМА). (Бабушкина А.В., 2009). Помимо этого, у больных ХБП снижена биодоступность NO в результате оксидантного стресса и образования пероксинититритов (И.И.Топчий и соавт., 2008). Вместе с тем, эндотелиальный монослой на внутренней поверхности кровеносных сосудов является не только наибольшей по объему железой внутренней секреции – он служит также полупроницаемым барьером на пути перемещения питательных веществ, сигнальных молекул и клеток  крови в ткани. Нарушение барьерной функции эндотелия происходит как за счет сокращения клеток и появления межклеточных щелей, сквозь которые свободно проходят молекулы любого размера, так и в связи с нарушением его регенерации при ускоренном апоптозе клеток, связанном с наличием хронического эндотоксинового дистресс-синдрома (Ан Е.С. 2009; Синяченко О.В., 2007; Mehta D., Malik A. B., 2006). В течение прошлого десятилетия наиболее доступным морфологическим маркером повреждения эндотелия стали циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦЭК), которые использовались как показатель нарушения целостности эндотелия при множестве заболеваний (Blann A.D. 2005). Были проведены некоторые исследования при сердечно-сосудистых заболеваниях, приведшие к следующей вехе в методологии – открытии С-Endo 1 антигена. Соответствующие антитела тогда позволили применять иммуномагнетическое выделение как наиболее достоверную методику (Blann A.D., 2005). Совсем недавно стали использовать сортировку клеток, активизированных флюоресценцией (FACS), а как показатель сосудистого здоровья стали рассчитывать соотношение между апоптозными клетками эндотелия (СD-146) и клетками-предшественниками (CD-34) (Woywodt A., 2006). У этих методик есть свои преимущества и недостатки, продолжаются дискуссии относительносно правомочности использования CD-34 как показателя эндотелиальных клеток-предшественников (Li B., et al., 2010). В связи с этим для определения состояния эндотелия у обследованных нами больных дополнительно определяли VE-кадгерин (СD-144), который является строго эндотелиальной молекулой адгезии, расположенной в соединениях между эндотелиальными клетками (Vestweber D., 2008; Dejana E., et al., 2008). Установлено повышение содержания VE-кадгерина в крови больных с острым коронарным синдромом (Soeki T. et al., 2004; Bernard S. et al., 2009), при васкулитах (Habibagahi Z. et al., 2010), однако взаимосвязь между морфологическими изменениями эндотелия и его NO-продуцирующей функцией остается мало изученной. В связи с этим целью нашей работы установление взаимосвязи нарушений функции эндотелия с показателем целостности эндотелиального монослоя в динамике лечения с применением L- аргинина.

   Материалы и методы.
Обследовано 112 больных с артериальной гипертензией, из них 61 мужчина (55%) и 51 женщина (45 %). Больные в возрасте от 20 до 39 лет составили 22,8 % , от 40 до 59 лет – 62,2 % , 60 и более лет – 15 %. По нозологическим критериям больные были разделены на следующие группы: 48 больных с хроническим пиелонефритом (ХрПН), 42 больных с гипертонической болезнью (ГБ) II стадии и 22 больных  с острым коронарным синдромом (ОКС, группа сравнения). Контрольную группу составили 18 практически здоровых лиц соответствующего пола и возраста. Диагноз ГБ и ОКС устанавливали в соответствии с рекомендациями Украинской ассоциации кардиологов (2004). Диагноз хронической болезни почек (ХБП) – согласно классификации Украинской ассоциации нефрологов (2005). Всем больным было проведено комплексное клиническое обследование с учетом жалоб, данных анамнеза, объективных и дополнительных методов исследований: клинические анализы крови и мочи, биохимические показатели – функциональные пробы печени, почек, показатели липидного обмена; электрокардиография в покое, суточное мониторирование АД и ЭКГ, рентгентелевидение органов грудной клетки, количественная двухмерная эхокардиография и эхосоноскопия почек. Изменение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) определяли по пробе Реберга-Тареева.
Кровь для биохимического исследования брали утром, на следующий день после поступления больного в стационар, через 12-18 часов после приема пищи. Забор крови проводили из локтевой вены силиконированной иглой, самотеком, в пробирки на льду с внесенными реактивами. Для изучения метаболизма оксида азота исследовали содержание нитрита (NO₂^–), а также сумму стабильных метаболитов NO – (N0₂^– + NO₃^–) в сыворотке крови спектрофотометрическим методом с реактивом Грисса (Орлова Е.А., 2002; Кіселик та співав., 2001). Содержание VE-кадгерина (СD-144) в плазме крови больных определяли иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы Bender MedSystems (Австрия), уровень фактора Виллебранда (vWF) – с помощью наборов фирмы Technoclone GmbH (Австрия). Содержание в крови циркулирующих клеток эндотелия определяли по методу Hladovec J., Boos C.J. (Hladovec J., Boos C.J., 2007). Исследуемые показатели изучали в динамике лечения с применением ингибиторов АПФ и блокаторов рецепторов к ангиотензину II. У больных ОКС исследуемые показатели определялись однократно при поступлении; все остальные больные находились на базовой гипотензивной терапии с применением ингибиторов АПФ, блокаторов рецепторов к ангиотензину II или бета-адреноблокаторов. Дозу препаратов подбирали индивидуально, при необходимости в процессе лечения дозу увеличивали. У 27 больных ХрПН и 23 больных ГБ наряду с базовой терапией применяли L-аргинин (Тивортин, «Юрия-фарм»). Препарат в виде 4,2% раствора в количестве 100 мл вводили внутривенно капельно в сответствии с инструкцией производителя. Курс лечения во всех группах составлял в среднем 14-17 дней.

   Результаты и обсуждение
Анализ полученных результатов показал, что плазменная концентрация vWF и VE-кадгерина (СD-144), а также количество ЦЭК у больных c ОКС была достоверно выше, чем у больных с ГБ II (Табл. 1). Это свидетельствует о том, что содержания VE-кадгерина и фактора Виллебранда изменяются синхронно с нарушением целостности эндотелия в коронарных артериях. Такая же тенденция отмечена и при подсчете количества циркулирующих клеток эндотелия. (табл.1.). Значительных половых и возрастных различий по этим показателям выявлено не было. По данным регрессионного анализа, взаимосвязи между плазменной концентрацией vWF и CD-144, сывороточным альбумином и содержанием гемоглобина у обследованных больных выявлено не было.

   Концентрация нитрита была снижена как в группе с ГБ, так и с ХрПН (на 26,9% и 17,8%, соответственно, р <0,05 ), тогда как сумма (нитрит+нитрат) в группе больных с ГБ не отличалась от контроля, а в группе с ХрПН была выще контрольных значений на 26,0% (р <0,05), вероятно за счет активации индуцибельного звена синтеза NO. Содержание метаболитов NO в плазме крови больных с ОКС достоверно не отличалось от контроля, но характеризовалось высокими значениями разброса данных.
У больных ХрПН и ГБ скорость клубочковой фильтрации коррелировала с содержанием в крови стабильных метаболитов NO, что может говорить о снижении возможности буферного накопления NO в у пациентов с более выраженными изменениями в структуре эндотелия (табл. 2.).

   Снижение концентрации стабильных метаболитов NO в крови может быть обусловлено снижением синтеза оксида азота в результате дефицита субстрата NO-синтаз – L-аргинина, что было установлена нами в предыдущих исследованиях (Топчій І.І. та співав., 2008). Можно предположить также, что одной из причин снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота в крови является нарушение регенеративной способности эндотелия и снижение утилизации десквамированного эндотелия у больных с более тяжелым течением заболевания. В литературе последних лет сообщается об отрицательном влиянии повышения уровня пула циркулирующих клеток эндотелия на течение заболеваний сердечно-сосудистой системы (Puddu P. et al., 2010). О напряженности врожденного иммунитета у обследованных больных свидетельствует повышение агрегационных свойств нейтрофилов. Так у здоровых пациентов индекс их агрегации составил (15,1 ± 1,2)% и повышался у больных ХрПН в 1,5 раза (р< 0,05) (табл. 3).

   Применение стандартной ренопротекторной терапии оказывало достаточный по эффективности клинический результат – во всех обследованных группах отметили положительное влияние лечения с применением ингибиторов АПФ, блокаторов рецепторов ангиотензина II на СКФ и артериальное давление. Так СКФ у больных ХрПН с (86,7±7,1) мл/мин возросла при стандартной терапии до (97,4±7,2) мл/мин. Вместе с тем, наибольший эффект оказало применение комбинированной терапии в сочетании с тивортином: СКФ возросла с (95,7±5,8) мл/мин до (114,5±7,0) мл/мин (Р<0,05). По-видимому, существует тесное взаимодействие системы L-аргинин/оксид азота и РАС в регуляции гломерулярного артериального сопротивления и почечной гемодинамики в целом. Гломерулярный мезангий рассматривается в настоящее время как главный регулятор скорости гломерулярной фильтрации, изменение тонуса мезангиальных клеток и сосудов почек в ответ на изменения в системе L–аргинин/NO оказывает существенное влияние на капиллярный ультрафильтрационный коэффициент. При этом вызываемое ангиотензином II сокращение мезангиальных клеток может быть уменьшено в связи с усилением продукции NO эндотелием под влиянием тивортина, что согласуется с литературными данными о подавлении влияния асимметричного диметиларгинина – блокатора NOS – L-аргинином ([Teerlink T. Et al., 2009). Под воздействием лекарственной терапии, наряду со снижением АД и уменьшением протеинурии, происходила перестройка в соотношении стабильных метаболитов оксида азота (табл.1). Отмеченный дисбаланс в метаболизме оксида азота, под влиянием терапии уменьшился, при применении тивортина у больных с ХрПН и ГБ произошло возрастание концентраци и нитрита (р<0,05), суммы (нитрит+нитрат) (р<0,05). В конце периода наблюдения выявлена положительная корреляционная связь между концентрацией суммы (нитрит+нитрат) и уровнем АД (г=+0,52, р<0,05 ), что может быть связано с увеличением синтеза NO или высвобождением NO из депо под влиянием проводимой терапии. Возможно, это связано и с улучшением регенерационной способности эндотелия, так как содержание циркулирующих клеток эндотелия при назначении тивортина уменьшалось более значительно, чем при проведении стандартной терапии (табл. 1).

   Известно, что NO играет важную и уникальную роль в функционировании почек, он оказывает свое действие на кровоток не только как магистральное сосудорасширяющее средство, но и как постоянный антагонист различных вазоконстрикторов в системе капилляров почек (Yu B., et al, 2010). Снижение синтеза оксида азота или уменьшение его биодоступности при ХБП приводит к нарушению перфузии тканей почки, которая и так уже уменьшена в связи с фиброзирущим процессом (Wen X., et al., 2010). Кроме того, хронические воспалительные заболевания почек могут приводить к несостоятельности межклеточных контактов эндотелиоцитов как это происходит при ишемии, сепсисе, токсемии, различных аллергических состояниях (Lampugnani M.G., et al., 1993; Cohen R. I. et al., 2001 Heemskerk S., 2006).
В же время, само воспаление как защитная реакция организма включает в себя компонент активации клеток белой крови и повышения активности индуцибельной NOS, что приводит к локальному повышению проницаемости микрососудов с целью ликвидации причины воспаления. К агентам, вызывающим повышение проницаемости сосудистого эндотелия, относятся тромбин, гистамин, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), брадикинин, бактериальный эндотоксин, фактор некроза опухоли, активные формы кислорода, избыточная механическая деформация. Перечисленные вещества действуют в разных патофизиологических контекстах и по разным механизмам, но приводят к единому результату – модуляции барьерной функции эндотелия сосудов за счет изменения контактных взаимодействий эндотелиальных клеток.
Ранее нами было установлено, что у больных ХБП наблюдается значительное снижение по сравнению с контрольной группой уровня L-аргинина (Топчий И.И. и соавт., 2006). Cледствием ограничения доступности субстрата для NO-синтаз является обнаруженное нами снижение уровня маркера эндогенного синтеза NO – нитрита: на 21,5 % при ХрПН (р<0,05) и на 12,8% при ГБ (р<0,05) по сравнению с контрольной группой. Кроме того, оксидантный стресс приводит к разобщенности NO-синтаз, с увеличением активности iNOS при наличии воспалительного процесса в почках (Топчий И.И. и соавт., 2009).
Основное биологическое действие ADMA – ингибирование синтеза NO и теоретически такое ингибирование может быть преодолено воздействием больших доз L-аргинина, которая является субстратом для NO-синтаз. Однако, противодействие ADMA только большими дозами L-аргинина, по-видимому, не является адекватным вмешательством для ограничения кардиотоксических влияний этого вещества.
Конститутивные изоформы NOS – восприимчивы к ингибирующему влиянию повышенного уровня NO и некоторые исследователи предположили, что воспаление может вызвать iNOS-зависимое уменьшение активности eNOS, что приводит к ухудшению капиллярного гомеостаза и функции почек (Schwartz, D., 1999). Другими словами, локальные микромолярные концентрации NO не могут оказывать существенного влияния на активность iNOS, но могут фактически ингибировать активность eNOS, усиливая чувствительность почек к действию вазоконстрикторов и уменьшая почечный кровоток в результате увеличенного сосудистого сопротивления. Эта селективная разобщенность NOS приводит к нарушению авторегуляции, что может привести к преренальному снижение СКФ при ХБП. Уменьшение активности eNOS полностью предотвращалось при селективном ингибировании iNOS in vitro и in vivo (Heemskerk S. Et al., 2009). Однако, определенное количество NO необходимо для сохранения СКФ при эндотоксемическом шоке, учитывая его сосудорасширяющие эффекты на приводящую артериолу (Chauhan S.D., 2003). В дополнение к гемодинамическим эффектам даже необольшое количество эндогенного NO предотвращает гломерулярный тромбоз при эндотоксинемии у крыс. По этим причинам селективное ингибирование iNOS, оставляя неизменным физиологическок содежание eNOS, может быть новым подходом для лечения болезни почек (Schwartz, D., 1997). Положительное влияние Tивортина^® может быть связано и с метаболизмом L-аргинина, так как по данным R.Komers et al (2003) инфузия L-аргинина – субстрата для eNOS и конкурента АДМА – у практически здоровых добровольцев нормализовала АД. Эти данные согласуются с наблюдением Watanabe G. Et al. (2000), которые установили, что назначение L-аргинина приводило к улучшению почечной функции, что было расценено авторами как дополнительное влияние лечения на окислительный стресс.

   Выводы
1. У больных острым коронарным синдромом, хроническим пиелонефритом и гипертонической болезнью повышается количество циркулирующих эндотелиальных клеток и содержание VE-кадгерина в плазме крови, что свидетельствует о нарушении целостности эндотелиального монослоя как  в капиллярах почек, так и в артериальных сосудах.
2. Одновременно с нарушением целостности эндотелия у больных ОКС, ХрПН и ГБ снижается содержание в плазме крови стабильных метаболитов NO₂ и NO₃ , что может быть обусловлено как уменьшением активности eNOS, так и снижением содержания субстрата для NOS – L-аргинина.
3. Применение препарата Тивортин^® (L-аргинин) для внутривенного введения на фоне общепринятой гипотензивной и ренопротекторной терапии способствовало улучшению показателей целостности эндотелия и его NO-продуцирующей способности .

  Материалы напечатаны в СІМЕЙНА МЕДИЦИНА, №3, 2010